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蛋白結晶研究入門(mén)全攻略:輕松開(kāi)啟生命科學(xué)探索之旅

蛋白質(zhì)結晶是研究蛋白質(zhì)結構和功能的關(guān)鍵手段,對理解生物大分子作用、疾病機制及藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。它涉及蛋白質(zhì)分子在溶液中規則堆積形成有序晶體的過(guò)程,受蛋白質(zhì)純度、濃度、緩沖液成分等多種因素影響。為獲高質(zhì)量晶體,需進(jìn)行樣品制備、條件篩選與優(yōu)化等。蛋白結晶研究推動(dòng)生物學(xué)和醫學(xué)領(lǐng)域發(fā)展,支持藥物設計和蛋白質(zhì)工程。本文概述了蛋白質(zhì)結晶的制備、方法、篩選、優(yōu)化等要點(diǎn),為相關(guān)研究提供參考。

一 蛋白質(zhì)晶體的發(fā)展史

蛋白質(zhì)晶體的研究始于19世紀中期,Hunefeld首先報道了血紅蛋白晶體。到了20世紀,結晶技術(shù)成為提純和研究蛋白質(zhì)的重要方法,特別是John Jacob Abel對胰島素的結晶,以及James B. Sumner對酶作為晶體蛋白質(zhì)的確認。1930年代末,蛋白質(zhì)晶體開(kāi)始用X射線(xiàn)分析,開(kāi)啟了結構生物學(xué)的新篇章。隨著(zhù)遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,特別是DNA技術(shù)的應用,蛋白質(zhì)晶體的研究在1980年代后得到了極大的加速和變革。

蛋白結晶:藝術(shù)與科學(xué)的結合

盡管現代分子生物學(xué)和晶體學(xué)的進(jìn)步為許多實(shí)驗提供了便捷,但蛋白質(zhì)結晶仍然是一個(gè)既簡(jiǎn)單又復雜的挑戰。這一過(guò)程結合了科學(xué)的方法與藝術(shù)般的直覺(jué)和創(chuàng )造力,然而又高度依賴(lài)經(jīng)驗的積累。

由于生物大分子(如蛋白質(zhì))由大量不同原子以復雜方式組合,結晶過(guò)程中存在諸多變量和影響因素。這些因素包括蛋白質(zhì)純度、濃度、pH值、離子強度等,每一個(gè)變量都可能對結晶結果產(chǎn)生顯著(zhù)影響(表12)。

1. 影響蛋白質(zhì)晶體生長(cháng)的化學(xué)變量

 

樣品的純度

基因修飾

 

樣品的構象靈活性

分子的對稱(chēng)性

 

樣品的均一性

樣品的穩定性和變性程度

 

PH值和緩沖液

等電點(diǎn)

 

沉淀劑的類(lèi)型和濃度

存在his標簽和其他純化標簽與否

 

樣品的濃度

熱穩定性

 

添加劑、輔助因子、配體、抑制劑、效應劑和輔料

PH穩定性

 

混沌劑,如尿素、鹽酸胍、硫酸銨等

樣本的獲取、處理、保存等歷史過(guò)程

 

洗滌劑

蛋白水解

 

金屬離子

微生物污染

 

離子強度

樣品保存

 

還原劑或氧化劑

樣品處理及相關(guān)的清潔度

 

樣品是來(lái)源

陰、陽(yáng)離子類(lèi)型及濃度

 

無(wú)定形顆粒物質(zhì)

相對過(guò)飽和度

 

翻譯后修飾

其他試劑的初始濃度和最終濃度

 

化學(xué)修飾

平衡的路徑和速率

 

2.可能或確實(shí)影響蛋白質(zhì)晶體生長(cháng)的物理變量

溫度

電磁場(chǎng)

平衡速率

結晶裝置的表面

結晶方法

試劑的粘度

重力、對流和沉降

異質(zhì)和外延成核劑

振動(dòng)和聲音

結晶裝置的幾何形狀

樣品和試劑的體積

時(shí)間

壓力

試劑的介電性能

結晶實(shí)驗通常從篩選開(kāi)始,旨在找到能產(chǎn)生晶體的關(guān)鍵變量組合。然而,為了獲得具有特定特性的晶體(如用于結構生物學(xué)、純化或生物治療研究),往往需要進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(表3和表4)。

3.結晶方法-過(guò)飽和度的實(shí)現

氣相擴散法(Sitting, Hanging, Sandwich)

序列提?。〝祿幚砗头治黾夹g(shù))

分批結晶法(微分批結晶)

pH誘導(簡(jiǎn)單、可控)

透析技術(shù) (微透析技術(shù)發(fā)揮輔助作用)

溫度誘導(操作簡(jiǎn)便、成本較低,需與其他方法結合使用)

自由界面擴散(逆擴散, 液橋)

效應物添加(也加Silver Bullet)

控制蒸發(fā)

 

4.蛋白質(zhì)結晶所用試劑

鹽類(lèi) (硫酸銨、甲酸鈉、磷酸銨等)

非揮發(fā)性有機物((±)-2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、甘油等)

聚合物 (聚乙二醇、分子量范圍在20020,000之間、乙烯亞胺、杰凡尼®)

緩沖液 (HEPES、Tris、醋酸鈉、MES)

揮發(fā)性有機物 (2-丙醇、1,4-二氧六環(huán)、乙醇等)

添加劑 (氯化鈣、氯化鈉、三(2-羧乙基)膦、n-辛基-β-D-葡糖苷等)

盡管現代技術(shù)提供了豐富的資源和工具,但結晶并非僅僅是使用這些工具那么簡(jiǎn)單。成功的結晶策略需要基于一些基本原則,正如Alex McPherson等結晶領(lǐng)域的先驅所提出的,在進(jìn)行實(shí)驗之前,考慮這些原則將為您的結晶工作提供堅實(shí)的基礎。

蛋白結晶的關(guān)鍵要素


  • 樣本:樣本的純度是結晶成功的基石,需細致處理以保證樣本高均一性。
  • 均一性:蛋白質(zhì)樣品的化學(xué)結構和分子量的一致性對形成有序晶體至關(guān)重要。
  • 溶解度:優(yōu)化樣本在緩沖液中的溶解條件,追求單分散性,避免聚集和沉淀。
  • 穩定性:確保蛋白質(zhì)在結晶過(guò)程中保持結構和功能穩定,避免變性。
  • 超飽和:通過(guò)控制超飽和度,誘導蛋白質(zhì)分子有序排列形成晶核。
  • 締合:調控蛋白質(zhì)分子間的有序相互作用,促進(jìn)有序聚集,避免非特異性聚集。
  • 成核:控制溶液中蛋白質(zhì)初始結晶核的形成,以?xún)?yōu)化晶體數量、大小和質(zhì)量。
  • 多樣性:嘗試多種方法和條件來(lái)發(fā)現適合特定蛋白質(zhì)的結晶條件。
  • 控制:精確調控實(shí)驗條件和過(guò)程,確保實(shí)驗結果的準確性和可重復性。
  • 雜質(zhì):保持樣品純度,減少雜質(zhì)對結晶和后續研究的干擾。
  • 保存:妥善保護結晶出的蛋白質(zhì)晶體,防止其受到損害,確保后續研究的可靠性。







         西美杰代理的美國Hampton Research公司是一家專(zhuān)注于蛋白質(zhì)晶體研究的領(lǐng)先生產(chǎn)商,其廣泛的產(chǎn)品組合涵蓋了從結晶初步篩選到結晶優(yōu)化篩選,再到定制單組分結晶試劑和結晶生長(cháng)優(yōu)化試劑等全方位產(chǎn)品。這些產(chǎn)品能夠滿(mǎn)足不同蛋白結晶研究的需求,包括普通蛋白、膜蛋白以及蛋白復合體的結晶。


西美杰代理的Hampton Research以其尖端的生物大分子結晶技術(shù)和實(shí)用豐富的產(chǎn)品線(xiàn),為全球晶體研究人員提供了全面的晶體研究試劑和實(shí)驗耗材。這些產(chǎn)品不僅極大地提升了科研人員的工作效率,而且幫助他們取得了卓越的科研成果,Hampton Research已成為晶體研究領(lǐng)域備受信賴(lài)的品牌之一。

西美杰Hampton Research蛋白結晶熱銷(xiāo)產(chǎn)品

Hampton Research蛋白結晶篩選試劑盒

品牌

貨號

品名

規格

簡(jiǎn)介

Hampton

HR2-144

Index

10 ml, tube format

蛋白質(zhì)、絡(luò )合物、多肽、核酸和水溶性小分子等多種試劑體系的經(jīng)典結晶條件初篩選試劑盒,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-110

Crystal Screen

10 ml, tube format

蛋白、可溶性多肽、核酸和水溶性小分子等多種試劑體系結晶條件初篩試劑盒,包含50個(gè)條件

Hampton

HR2-112

Crystal Screen 2

10 ml, tube format

蛋白、可溶性多肽、核酸和水溶性小分子等多種試劑體系結晶條件初篩試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-114

MembFac

10 ml, tube format

適用于膜蛋白的結晶條件初篩試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-116

Natrix

10 ml, tube format

核酸、核酸/蛋白質(zhì)復合物結晶條件初篩試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-117

Natrix 2

10 ml, tube format

核酸、核酸/蛋白質(zhì)復合物結晶條件初篩試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-082

PEGRx 1

10 ml, tube format

聚合物和pH條件初篩與二次篩選試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-084

PEGRx 2

10 ml, tube format

聚合物和pH條件初篩與二次篩選試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-126

PEG/Ion Screen

10 ml, tube format

聚合物、鹽和pH條件初篩與二次篩選試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-098

PEG/Ion 2 Screen

10 ml, tube format

聚合物、鹽和pH條件初篩與二次篩選試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-107

SaltRx 1

10 ml, tube format

鹽和pH條件初篩與二次篩選試劑盒,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-109

SaltRx 2

10 ml, tube format

鹽和pH條件初篩與二次篩選試劑盒,包含48個(gè)條件

除上述產(chǎn)品外,西美杰還提供包括GRAS Screen?、Grid Screen系列、Low Ionic Strength Screen、XP Screen、JBScreen Wizard等等在內的多種結晶條件篩選試劑盒,歡迎致電西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006咨詢(xún)訂購。

Hampton Research蛋白結晶優(yōu)化試劑盒

品牌

貨號

品名

規格

簡(jiǎn)介

Hampton

HR2-072

Solubility & Stability Screen

0.5 ml, Deep Well block format

溶解度和穩定性篩選,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-413

Solubility & Stability Screen 2

0.5 ml, Deep Well block format

溶解度和穩定性篩選,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-070

Slice pH

0.5 ml, Deep Well block format

pH篩選試劑盒,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-138

Additive Screen

1 ml, Deep Well block format

添加劑篩選試劑盒,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-459

GRAS Additive

1 ml, Deep Well block format

GRAS添加劑篩選,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-096

Silver Bullets

0.50 ml, Deep Well block format

添加劑篩選試劑盒,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-407

Detergent Screen

0.25 ml, Deep Well block format

洗滌劑篩選試劑盒,包含96個(gè)條件

Hampton

HR2-214

Ionic Liquid Screen

0.5 ml, tube format

離子液體篩選試劑盒,包含24個(gè)條件

Hampton

HR2-241

StockOptions pH

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含45個(gè)條件

Hampton

HR2-235

StockOptions Sodium Citrate

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含24個(gè)條件

Hampton

HR2-239

StockOptions Sodium Cacodylate

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含24個(gè)條件

Hampton

HR2-243

StockOptions MES

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含20個(gè)條件

Hampton

HR2-103

StockOptions Bis-Tris Propane

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含33個(gè)條件

Hampton

HR2-102

StockOptions HEPES

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含15個(gè)條件

Hampton

HR2-227

StockOptions Polymer

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含23個(gè)條件

Hampton

HR2-245

StockOptions Salt

10 ml, tube format

晶體生長(cháng)篩選試劑盒,包含49個(gè)條件

Hampton

HR2-073

CryoPro

1 ml, tube format

晶體冷凍保護劑篩選,包含48個(gè)條件

Hampton

HR2-501

50% v/v Jeffamine® M-600® pH 7.0

200 ml

結晶級Jeffamine M-600用于結晶條件優(yōu)化

Hampton

HR2-525

50% w/v Polyethylene glycol 1,500

200 mL

結晶級PEG 1500用于結晶條件優(yōu)化

Hampton

HR2-527

50% w/v Polyethylene glycol 3,350 Monodisperse

200 mL

結晶級PEG 3350用于結晶條件優(yōu)化

Hampton

HR2-529

50% w/v Polyethylene glycol 4,000

200 mL

結晶級PEG 4000用于結晶條件優(yōu)化

以上試劑盒中的單組分條件可單獨訂購。除上述試劑盒外,西美杰還提供包括Proti-Ace?、Silica Hydrogel Kit、Heavy Atom Screens、I3C Phasing Kit等多款結晶優(yōu)化篩選試劑盒及試劑,歡迎致電西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006咨詢(xún)訂購。

Hampton Research蛋白結晶耗材工具

品牌

貨號

品名

規格

簡(jiǎn)介

Hampton

HR2-320

Seed Bead Kit

24 tubes with PTFE Seed Bead

晶種制備珠

Hampton

HR3-105

MASTERBLOCK® 96 Deep Well polypropylene plate

50 plate case

96孔深孔板

Hampton

HR3-081

72 Well Microbatch Plate, Greiner 654102

untreated, hydrophobic - 270 plate case

72孔油下結晶板

Hampton

HR3-125

Swissci 3 Well Midi Crystallization Plate in UVP (40)

40 plate case

3微孔/96孔坐滴板

Hampton

HR3-158

Cryschem Plate

24 plate case

24孔坐滴板

Hampton

HR3-231

22 mm x 0.22 mm Siliconized circle cover slides

1.0 ounce pack (~120 slides)

圓形硅化玻璃蓋玻片

Hampton

HR3-233

22 mm x 0.22 mm Siliconized circle cover slides

10.0 ounce case (~1,200 slides)

圓形硅化玻璃蓋玻片

Hampton

HR3-609

Crystal Clear Sealing Film

100 pack

結晶板封口膜

Hampton

HR4-216

Crystal Crusher

5 pack

晶體粉碎器

Hampton

HR4-217

Crystal Probe

12 pack

一次性不銹鋼晶體針

Hampton

HR4-733

CrystalCap

with Vial - 60 pack

晶體環(huán)底座

Hampton

HR4-811

Micro-Tools Set

each

晶體處理工具套裝,含8個(gè)不同形狀的晶體探針

除上述產(chǎn)品外,西美杰還提供各種規格結晶板、loop、微橋、密封膠,Pucks等工具耗材及整套工具箱,幫助研究人員更快更高效的開(kāi)展實(shí)驗。歡迎致電西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006咨詢(xún)訂購。


西美杰作為Hampton Research在中國的官方授權代理,致力于為用戶(hù)提供卓越的技術(shù)支持和周到的售后服務(wù)。西美杰始終秉持“We promise what we can do. We do what we have promised”的核心理念,為用戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。若您想了解更多產(chǎn)品信息,歡迎致電北京西美杰全國客服熱線(xiàn)400-050-4006或登錄官網(wǎng)www.cijlm.cn進(jìn)行查詢(xún)和了解。

References and Readings

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11.Crystallization of Biological Macromolecules, McPherson, A.(1999)Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

12Introduction to protein crystallization, McPherson, A. and Gavira, J.A.(2014) Acta Crystallographica F, Volume 70, Part 1, 2-20.

13.Some Words of Advice from an Old Hand, Alexander McPherson, pages1-9, in Protein Crystallization, Second Edition, Edited by Terese Berg-fors. International University Line, 2009.

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